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ctDNA檢測在腫瘤精準治療中的應用

發布時間:2021-12-05 13:53:31 | 來源:【藥物研發團隊 2021-12-05】
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腫瘤液體活檢主要是指循環腫瘤細胞(CTC)、循環腫瘤DNA(ctDNA)、循環游離DNA(cfDNA)等生物標志物檢測。與腫瘤組織活檢比較,腫瘤液體活檢具有微創、便利、可以實時監測腫瘤狀態、患者依從性好等優勢,其中ctDNA檢測更受腫瘤臨床青睞。

ctDNA是指腫瘤細胞體細胞DNA經脫落或者當細胞凋亡后釋放進入循環系統,是一種特征性的腫瘤生物標記。通過ctDNA檢測,能夠檢出血液中的腫瘤蹤跡。

ctDNA是一種無細胞狀態的胞外DNA,存在于血液、滑膜液和腦脊液等體液中,其主要是由單鏈或雙鏈DNA以及單鏈與雙鏈DNA的混合物組成,以DNA蛋白質復合物或游離DNA兩種形式存在。它是一種具備廣泛應用前景、高敏感性、高特異性的腫瘤標志物,且適用于多種腫瘤。與蛋白類標記物相比,ctDNA檢測很少出現假陽性,因為ctDNA來自腫瘤細胞基因組突變。另外,ctDNA半衰期短,能準確反映腫瘤的當前情況。

近年來,基因深度檢測、富集、定性和定量等檢測技術快速發展,ctDNA檢測技術日臻完善,已在多個靶向藥物中獲批作為伴隨診斷用于腫瘤精準治療,將在腫瘤精準治療中發揮重要作用。

一、ctDNA作為腫瘤生物標志物的發現

1947年,Mandel和Metais發現血漿中存在游離的核酸分子;1977年,Leon等人發現,腫瘤患者的血漿游離DNA水平要明顯高于健康人群。之后研究者在腫瘤患者的血漿和血清中檢測到了癌基因突變,并且與原發腫瘤相一致,發現了癌癥患者的循環 DNA。1994年,人們發現這種攜帶了突變信息的循環DNA是腫瘤的標志。人們逐漸認識到ctDNA中攜帶腫瘤特有突變的那一小部分DNA,確實是由腫瘤細胞釋放出來的,ctDNA的研究與腫瘤關聯起來。2007 年,美國約翰霍普金斯大學 Bert Vogelstein 和 Kenneth Kinzler 對 18 名腸癌患者的 ctDNA 進行了跟蹤。研究顯示,術后仍檢測到 ctDNA 的患者,基本上都出現了復發,而術后未檢測到 ctDNA 的患者,腸癌無復發。由此拉開了ctDNA作為腫瘤生物標志物研究的序幕。

二、臨床意義

ctDNA就像是腫瘤細胞留在血液中的指紋,讓我們有可能僅僅憑借一管血,就可以追查到腫瘤的真兇,分析它的各項特征,從而為消滅這個兇手提供不可或缺的信息。在幾乎所有種類的癌癥中,都檢測到了ctDNA所帶有的標志性突變,并且腫瘤越晚期,病情越嚴重,腫瘤的惡性程度越高, ctDNA特有突變的頻率就越高。

一項針對15種癌癥進行的ctDNA測序研究顯示,分別有47%,55%,69%,82%的I~IV期癌癥病人中能檢測到高于一定頻率的ctDNA突變;而另一項使用更高靈敏度測序技術的研究則表示,對于II期以上的病人,均能100%檢測到突變。ctDNA來自腫瘤細胞的體細胞突變,不同于遺傳突變的是其存在于體內每個細胞。因此,ctDNA是一種特征性的腫瘤生物標記物,并且還可以被定性、定量和追蹤。

三、ctDNA在腫瘤精準治療中的作用

ctDNA檢測很少有假陽性,而且ctDNA的半衰期只有不到兩小時,ctDNA能更清晰的反映腫瘤的當前信息,能夠對腫瘤的演化和適應性改變進行監控。有研究表明,在檢測乳腺癌和腸癌時,ctDNA比蛋白質指標更靈敏,還可以跟蹤腫瘤的消失、擴散和復發。而組織活檢得到的是靜態信息,無法準確反映腫瘤的演化。在這種情況下,ctDNA就成為了科學家們的新希望,它能為人們揭示更多的腫瘤信息,甚至跟蹤腫瘤的發展   

ctDNA作為一種新的腫瘤生物標志物,將在腫瘤的診斷、治療及預后檢測等方面發揮重要作用,尤其對于一些不具有典型臨床癥狀、檢查無特異性和診斷困難的腫瘤,可避免復雜的、具有創傷性的活檢。隨著基因測序的飛速發展,已能在血液中對其進行檢測并計數。ctDNA基因測序對于發現早期或癌前階段腫瘤蹤跡具有重要意義,為腫瘤的治療提供時機,基于ctDNA的超早期腫瘤基因檢測(U-ets)將是未來腫瘤疾病預防、治療的研究和發展方向。

四、ctDNA檢測技術

ctDNA的檢測可分為定量和定性兩大類,可以檢測ctDNA突變性質和突變量。針對不同類型的腫瘤會用到不同的ctDNA檢測方法,主要有以下幾種:

1、Droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR。

2、Beads, emulsion, amplification and magnetics,BEAMing。

3、Tagged-amplicon deep sequencing,TAm-Seq。

4、Cancer personalized profiling by deep sequencing,CAPP-Seq。

5、Barcode sequencing technology、BCT。

6、Whole genome sequencing,WGS。

7、Whole exome sequencing,WES。

8、Whole genome bisulfite sequencing, WGBS-Seq。

五、ctDNA優勢

1、由于ctDNA來自腫瘤細胞基因組突變,因此與蛋白類標記物相比,ctDNA檢測很少出現假陽性。

2、ctDNA 半衰期短,能準確反映腫瘤當前情況。劍橋大學和約翰霍普金斯大學合作團隊研究表明,檢測乳腺癌和腸癌時,ctDNA 比蛋白質指標更靈敏,可跟蹤腫瘤的消失、擴散和復發。

3、ctDNA比循環腫瘤細胞更靈敏,更適合成為腫瘤的生物學指標。

六、ctDNA臨床應用前景

1.《ASCO年度報告:2015臨床腫瘤學進展》中,液體活檢技術被列為腫瘤治療領域下一個十年趨勢之一。ctDNA作為液體活檢的首選已逐漸從科研走向臨床。

而歐盟批準將ctDNA檢測用于易瑞沙的伴隨診斷則更是標志著ctDNA臨床應用的大規模實現。

2、2007 年,美國約翰霍普金斯大學 Bert Vogelstein對 18 名腸癌患者的 ctDNA 進行了跟蹤。研究顯示,術后仍檢測到 ctDNA 的患者,基本上都出現了復發,而術后未檢測到 ctDNA 的患者,腸癌無復發。表明ctDNA 能展現患者對手術的應答情況。隨后,研究者在其他癌癥中得到了類似結果,包括卵巢癌、乳腺癌以及其他器官腫瘤,比如胰臟、膀胱、皮膚、胃、食道、肝臟和頭頸。腦癌除外,因為血腦屏障使腦腫瘤DNA 無法進入血液。

3、2012 年,Diaz 團隊研究表明,ctDNA 檢測技術能更早監測到腫瘤進展。Rosenfeld 團隊則利用 ctDNA 揭示了腫瘤抗性的發展路徑。及時發現腫瘤抗性,能盡早停用不起作用且昂貴的藥;發現潛在抗性的突變,有助于尋找有效的抗腫瘤療法或者藥物組合。

4、2015年5月,約翰?霍普金斯大學的研究團隊首次在肺癌前期病變患者血液中檢測發現循環DNA,能夠有望應用于早期風險預測。同時,對肺癌前期病變組織進行活檢,也發現了循環DNA,該病變組織也稱為非典型腺瘤性增生(AAH),且游離DNA能夠侵入周圍組織,導致肺腺癌的癌變。

5、2015年11月,劍橋大學通過Pyclone方法檢測一例轉移性乳腺癌患者血液中ctDNA來實時追蹤腫瘤進展。研究者歷時1193天,從一名腫瘤已經擴散到身體其它部位的42歲女性乳腺癌患者身上,采集了腫瘤樣本(8個腫瘤位點)和血液樣本,進行外顯子和靶位點擴增測序(Pyclone)。如果在同一時間點上,活組織切片結果和進入血液中ctDNA片段結果相比較相一致,即說明腫瘤發展和相應治療時出現了相同的模式和遺傳變化時機,說明循環DNA可以實時追蹤腫瘤進展。

6、2020年8月7日,FDA批準Guardant 360 CDx作為伴隨診斷,用于識別攜帶表皮生長因子受體(EGFR)基因突變的轉移性非小細胞肺癌(NSCLC)患者,以幫助確定可以從Tagrisso (osimertinib)治療中獲益的患者。FDA設備與放射健康中心體外診斷與放射健康辦公室主任Tim Stenzel博士當時表示:“液體活檢以及NGS技術伴隨診斷的批準標志著突變檢測的新時代。”

7、2020年8月26日,羅氏旗下Foundation Medicine公司宣布美國FDA批準了其泛癌液體活檢產品FoundationOne Liquid CDx(F1LCDx)上市,用于多種伴隨診斷適應癥,包括一種前列腺癌和三種非小細胞肺癌。這是FDA批準的第二款基于NGS的液體活檢伴隨診斷大panel產品。

8、繼2020年10月26日FDA批準擴大F1LCDx的3個新伴隨診斷適應癥之后,2020年11月6日,FDA再一次批準擴大F1LCDx的新伴隨診斷適應癥,通過血漿ctDNA檢測進而識別受益于奧拉帕尼(利普卓)治療的BRCA1、BRCA2和ATM突變的轉移性去勢抵抗性前列腺癌(mCRPC)患者。

9、2021年,美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)前列腺癌指南首次將ctDNA檢測納入推薦,指出對于難以獲得腫瘤組織標本的晚期患者,液體活檢也是NGS(新一代測序技術)的有效補充。

2021年11月,中國臨床腫瘤學會(CSCO)發布了更新的前列腺癌臨床實踐指南,明確了可用于檢測的樣本類型包括腫瘤組織樣本、血漿ctDNA樣本和血液白細胞樣本。

10、轉移性結直腸癌患者經根治性切除后,至少有50%的患者會出現復發。究其原因,主要是由于術后患者體內仍存在微小/分子殘留病灶(MRD)。術后常規的復查手段包括腫瘤標志物CEA、CA199,增強CT或MRI很難檢出臨床上不明顯的MRD。既往有文獻報道ctDNA檢測用于評估MRD,來檢測腫瘤復發及判斷化療療效。但是就檢測方法而言,目前并沒有找到很有效的手段。之前比較常用的ddPCR技術只能檢測RAS基因的幾個位點的突變,敏感性較差,而且有50%左右的轉移性結直腸癌(mCRC)RAS基因為野生型,這就大大限制了它在MRD檢測中的應用。

 2021年發表在《臨床腫瘤學》(JCO)雜志子刊《臨床腫瘤學·腫瘤摘錄》(JCO Precis Oncol)的文章。該研究探索應用個體化的多通路PCR(ddPCR)、二代測序技術(Signatera, 定制的mPCR-NGS)來進行ctDNA檢測,用于術后監測MRD。該研究探討了基于ctDNA評估的MRD與mCRC患者無病生存(DFS)率之間的關系,對比了基于ctDNA評估的MRD與血漿CEA水平對疾病進展預測的能力,最后比較了個體化mPCR-NGS與ddPCR兩種技術用于ctDNA檢測的優劣。

研究者依據研究結果,建議針對mCRC的臨床研究最好能加上ctDNA檢測。因為術后MRD陽性的患者更可能從輔助治療中獲益,因此可能更準確的富集可納入研究的高危復發人群,較少入組人員及不必要的花費;另外,以ctDNA的降低及清除作為治療有效的指標可以加快新治療方法的審批。而該研究也提示通過個體化mPCR-NGS來檢測MRD的方法是目前最優的方法,值得進一步進行臨床研究。

七、ctDNA面臨問題

目前,ctDNA 還無法成為臨床上的主要診療手段。主要有以下原因:

1、最靈敏的ctDNA檢測( BEAMing)也需事先知道想要檢測的突變基因:通過活檢、測序和分子探針等流程。雖然外顯子組測序無需預先知道腫瘤信息,但成本高。

2、目前尚無標準的cfDNA提取方法,利用血漿還是血清,樣本采集中是否可以使用不同的抗凝劑,冷凍保存的時間差異等均會影響ctDNA的濃度。

3、活檢技術通常不能很好的檢測早期癌癥。

研究顯示,ctDNA能檢測出所有 II 級以上肺癌,但只檢測出了一半 I級腫瘤,因為晚期癌癥釋放更多的DNA,這將限制 ctDNA的癌癥篩查作用。

4、ctDNA是否來自未知腫瘤或轉移癌目前尚無法甄別。

5、目前最大的問題是準確的腫瘤信息能否挽救患者生命或改善腫瘤患者的生活質量。但不爭的事實是,ctDNA檢測可以助力靶向抗腫瘤藥物的精準治療,避免患者暴露于無效抗腫瘤藥物,且可實時監測抗腫瘤藥物治療效果,及時調整治療方案,特別是晚期腫瘤患者將在這一技術助力的精準治療下獲益。

 

文獻資料

1、周國鋒等,循環游離DNA在胰腺癌中的臨床應用進展,復旦學報(醫學版), 2018, 45(01):113-118

2、Heitzer E. et al.Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology.Nat Rev Genet (2018)

3、Li, H., Jing, C., Wu, J., Ni, J., Sha, H., Xu, X. ... Feng, J. (2019). Circulating tumor DNA detection: A potential tool for colorectal cancer management (Review). Oncology Letters, 17, 1409-1416

4、FDA Approves First Liquid Biopsy Next-Generation Sequencing Companion Diagnostic Test

5、https://www.fda.gov/drugs/fda-approves-liquid-biopsy-ngs-companion-diagnostic-test-multiple-cancers-and-biomarkers

6、中華醫學會檢驗醫學分會,國家衛生健康委員會臨床檢驗中心,液體活檢在臨床腫瘤診療應用和醫學檢驗實踐中的專家共識,中華檢驗醫學雜志,2018,41(10)

7、中國臨床腫瘤學會腫瘤生物標志物專家委員會《中國非小細胞肺癌患者EGFR T790M 基因突變檢測專家共識》制定專家組,中國非小細胞肺癌患者EGFR T790M基因突變檢測專家共識, 中華醫學雜志,2018,98(32)2544-2551.

8、中國臨床腫瘤學會指南工作委員會. 中國臨床腫瘤學會(CSCO)原發性肺癌診療指南,人民衛生出版社,2020

 

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